介紹

mRNA 疫苗是指將含有編碼抗原蛋白的 mRNA 導(dǎo)入人體，直接進(jìn)行翻譯，形成相應(yīng)的抗原蛋白，從而誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答，達(dá)到預(yù)防免疫的作用（圖1）。

mRNA 疫苗的優(yōu)勢主要有：

1. 研發(fā)周期短、抗原選擇范圍廣，任何可成蛋白的抗原序列均可被選擇

2. mRNA 疫苗的半衰期與免疫原性可通過修飾和遞送系統(tǒng)來人工調(diào)節(jié)，由于不進(jìn)入細(xì)胞核，無感染或插入突變的風(fēng)險(xiǎn)，安全性更高

3. 多種修飾后的 mRNA 更穩(wěn)定，在細(xì)胞質(zhì)中被高效攝取和表達(dá)；mRNA 疫苗具備自我佐劑特點(diǎn)，因此表現(xiàn)更強(qiáng)的免疫原性，有效性更高

4. 可通過體外轉(zhuǎn)錄技術(shù)快速、廉價(jià)地大規(guī)模生產(chǎn) RNA 疫苗，在掌了病毒基因序列后即可在 40 天內(nèi)完成疫苗樣品的生產(chǎn)制備

方法

該團(tuán)隊(duì)首先關(guān)注了磷脂和緩沖液對 LNP 本身溫度敏感性的影響。由于 DSPC 的相變溫度(Tm)為 55℃，接近噴霧干燥器的出口溫度，而 DOPE 是一種不飽和磷脂，Tm 為 -16℃，可改善LNP的溫度敏感性，并有研究發(fā)現(xiàn) DOPE 替代 DSPC 可以提高 mRNA 遞送效率[1]。LNP 中可電離脂質(zhì)的 pKa=7，因此 pH 值的大幅變化可能會導(dǎo)致顆粒結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性的變化，該團(tuán)隊(duì)測試了廣泛使用的 PBS 和 20 mM Tris 緩沖液的影響。該團(tuán)隊(duì)將四種不同的 LNP 配方（DSPC PBS；DSPC Tris；DOPE PBS；DOPE Tris）在不同溫度范圍孵育以模擬LNP配方和噴霧干燥過程的溫度跨度。發(fā)現(xiàn) DOPE Tris 組在高達(dá) 75℃ 的溫度下仍保持穩(wěn)定，并且在 80℃ 時(shí)僅損失約 20% 的 RNA。

在噴霧干燥的溫度條件下更穩(wěn)定不等于能更好地承受噴霧干燥過程，因此該團(tuán)隊(duì)還驗(yàn)證了 DOPE Tris LNP 能更好地承受噴霧干燥過程。DOPE Tris 組在噴霧干燥和復(fù)溶 306Oi10 和 MC3 LNP 時(shí)均增強(qiáng)了顆粒穩(wěn)定性。 Tris 緩沖液在噴霧干燥方面優(yōu)于PBS，雖然兩種緩沖液的 pH 值都會隨著溫度的升高而降低，但 Tris 的變化率比 PBS 快 10 倍，這意味著Tris緩沖液從 25°C 升至 37°C 時(shí) pH 將減少 0.3 個單位，而 PBS 僅減少 0.025 個單位，pH 值的降低可能會確保RNA仍被封裝在LNP中。作者還發(fā)現(xiàn)優(yōu)化的LNP配方(DOPE Tris)顯著提高了評估了 LNP 在肝細(xì)胞癌細(xì)胞系 HepG2 和肺支氣管細(xì)胞系 16HBE 中的攝取，與 4°C 下儲存的液體 LNP 制劑相比，通過噴霧干燥處理并在室溫下儲存的 LNP 具有更好的穩(wěn)定性、更高的顆粒封裝效率以及更顯著的蛋白質(zhì)表達(dá)（圖2）。

(A) 使用 DSPC 和 PBS 生產(chǎn)的 LNP 制劑對溫度升高敏感

(B) 當(dāng) DSPC 替換為 DOPE、PBS 替換為 Tris 時(shí)，噴霧干燥和重新分散后LNP顆粒的穩(wěn)定性顯著提高。

(C) LNP 制劑在噴霧干燥(SD)后穩(wěn)定性提高,導(dǎo)致  mRNA 對 HepG2 和 16HBE 細(xì)胞具有良好轉(zhuǎn)染效率。比例尺=100μm。**P<0.01、***P<0.001、****P< 0.0001、n.s=不顯著。

該團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)噴霧干燥 LNP 制劑時(shí)，在干燥塔內(nèi)可觀察到均勻的薄膜，在旋風(fēng)分離器中可觀察到薄膜沉積物，這是因?yàn)樵跓o賦形劑的情況下，噴霧干燥 LNP 制劑中每種成分的固化機(jī)制將根據(jù)其擴(kuò)散速率和溶解度而有所不同，引起各組分分離。因此該團(tuán)隊(duì)優(yōu)化了 LNP、海藻糖、三亮氨酸的比例[2]。發(fā)現(xiàn) LNP 與三亮氨酸的比例為 1:4 至 1:5 時(shí)，可以減少旋風(fēng)分離器中的粉末損失，并進(jìn)一步提高復(fù)溶后的 mRNA 封裝效率，將 LNP 負(fù)載從 1.5% 增加到 5%。噴霧干燥后，通過 SEM 分析粉末粒徑和表面結(jié)構(gòu)，通過 CryoTEM 分析復(fù)溶的顆粒。發(fā)現(xiàn)噴霧干燥后復(fù)溶的 LNP 樣品為尺寸范圍變化更大的致密小囊泡（圖3）。

(A) 粉末配方中三亮氨酸(LLL):LNP 比例的優(yōu)化可將旋風(fēng)分離器中的損失降至zui低，并隨著重構(gòu)后 RNA 封裝效率 (%EE) 的增加而實(shí)現(xiàn)產(chǎn)量zui大化。

(B) 噴霧干燥產(chǎn)生 LNP 的掃描電鏡照片。當(dāng)三亮氨酸(LLL)的濃度從 3% 增加到 15% 時(shí)，顆粒的形態(tài)逐漸從光滑的表面變成高度波紋狀的表面。

(C) 新制 LNP 和噴霧干燥 LNP 代表性冷凍透射電子顯微鏡圖片。與新鮮 LNP 相比，噴霧干燥 LNP 復(fù)溶后被包裹在致密的襯里。比例尺 =200nm。 

接下來，該團(tuán)隊(duì)驗(yàn)證了 mRNA LNP 粉末制劑在體內(nèi)的功能性遞送。使用 Penn-Century Dry Powder Insufflator™-4 裝置對動物進(jìn)行給藥，該裝置可以將粉末直接輸送到大鼠的肺部。肺組織切片上的免疫組化(IHC)顯示出強(qiáng)烈的 eGFP 陽性細(xì)胞染色。這些細(xì)胞根據(jù)其定位、形態(tài)和免疫熒光標(biāo)記被鑒定為細(xì)支氣管上皮細(xì)胞、II 型肺細(xì)胞和/或巨噬細(xì)胞。盡管僅識別出少數(shù) eGFP 陽性細(xì)胞，但這些陽性細(xì)胞的染色強(qiáng)烈、且無背景噪點(diǎn)，表明 eGFP mRNA LNP 在噴霧干燥后吸入給藥，可在肺部產(chǎn)生清晰的 eGFP 表達(dá)。

(A) 大鼠肺示意圖

(B) 研究設(shè)計(jì)的示意圖。

單次給藥后 24 小時(shí)或連續(xù)3天每日給藥后 24 小時(shí)處死大鼠。給藥方式包括氣管內(nèi)(IT)滴注含有 eGFP mRNA LNP 的噴霧干燥制劑或安慰劑。

(C) 在右肺葉的肺勻漿中測量的 eGFP 蛋白水平

(D) 顯示 eGFP 陽性細(xì)胞（紫色）的圖像

(E) IT 滴注單次(I和III）和 3 天重復(fù)(II和IV)給藥后 24 小時(shí)在大鼠左肺葉中檢測到的 eGFP(棕色)。eGFP 陽性細(xì)胞（紫色）形態(tài)學(xué)上鑒定為細(xì)支氣管上皮細(xì)胞 (D I) 和 II 型肺細(xì)胞和巨噬細(xì)胞 (D II)。在細(xì)支氣管上皮細(xì)胞(E I)和 II 型肺細(xì)胞和巨噬細(xì)胞(E II)中鑒定出 eGFP mRNA (棕色)。

(F) eGFP 的免疫熒光標(biāo)記與 II 型肺細(xì)胞或巨噬細(xì)胞標(biāo)記物結(jié)合，證實(shí)兩種細(xì)胞類型都表達(dá) eGFP。

(G) 左肺葉的組織病理學(xué)分析結(jié)果。

左上：來自對照大鼠的肺組織，顯示沒有bing變。

左下：治療 3 天的大鼠肺組織，顯示肺泡實(shí)質(zhì)中的實(shí)變區(qū)域，代表炎癥病變（箭頭）。

中圖：混合炎癥細(xì)胞浸潤區(qū)域的較高放大倍數(shù)，以較小的氣道和描繪肺泡管為中心。

右圖：代表次級細(xì)支氣管上皮變化的圖像。

結(jié)論

總的來說，該研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)行了一項(xiàng)概念驗(yàn)證研究，并成功通過配方優(yōu)化，設(shè)計(jì)出了用于吸入的 mRNA LNP 噴霧干燥制劑。該制劑在經(jīng)過噴霧干燥和復(fù)溶后仍保持功能，并可在體外和體內(nèi)有效遞送 mRNA，能夠以臨床相關(guān)劑量水平實(shí)現(xiàn) LNP 的肺部給藥，在吸入式 mRNA 疫苗領(lǐng)域開辟了新道路，具有巨大前景。

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參考文獻(xiàn)

1. Chaudhary, N., Weissman, D. & Whitehead, K.A. mRNA vaccines for infectious diseases: principles, delivery and clinical translation. Nat Rev Drug Discov 20, 817–838 (2021).

2. Friis K P, Gracin S, Oag S, et al. Spray dried lipid nanoparticle formulations enable intratracheal delivery of mRNA[J]. Journal of Controlled Release, 2023, 363: 389-401.