在過(guò)去幾年中，脂質(zhì)納米顆粒（LNPs）已被發(fā)現(xiàn)是 RNA 傳遞的有效載體，有多個(gè)傳染病和癌癥治療的臨床試驗(yàn)可證實(shí)。以 mRNA 為載體的疫苗對(duì)于治療嚴(yán)重疾病如嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2型（SARS-CoV-2）的成功一定程度上可歸功于開(kāi)發(fā)了包含 mRNA 的 LNPs 以實(shí)現(xiàn)有效的細(xì)胞內(nèi)傳遞。本文探討了噴霧干燥工藝作為凍干以外的另一種脫水過(guò)程，可以提高 LNPs 的穩(wěn)定性并提供可替代的給藥途徑。

RNA 疫苗的挑戰(zhàn)

疫苗液體配方的穩(wěn)定性問(wèn)題可能成為其工業(yè)化和分銷的障礙。高溫可能會(huì)影響疫苗的穩(wěn)定性因此，通常需要冷鏈系統(tǒng)來(lái)保持疫苗的活性。mRNA 儲(chǔ)存過(guò)程中的化學(xué)不穩(wěn)定性包括 N-糖苷鍵的水解、磷酸二酯鍵的水解、胞嘧啶衍生物的脫氨和核堿基或糖部分的氧化。然而，當(dāng)疫苗轉(zhuǎn)化為干粉時(shí)，可獲得更強(qiáng)的熱穩(wěn)定性和更長(zhǎng)的保質(zhì)期。

利用凍干技術(shù)制備 RNA 疫苗

凍干或冷凍干燥是干燥疫苗常用的方法，處理過(guò)程由三部分組成：

較高的冷凍溫度、較慢的冷凍速率和較長(zhǎng)的次級(jí)干燥時(shí)間都有利于干燥過(guò)程的穩(wěn)定性。然而，在這個(gè)復(fù)雜的過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生應(yīng)力源，如冷凍和干燥應(yīng)力。冰對(duì)顆粒產(chǎn)生的機(jī)械應(yīng)力和 PEG 層的結(jié)晶會(huì)導(dǎo)致顆粒融合，這些都是在冷凍過(guò)程中可能發(fā)生的情況。冷凍保護(hù)劑或凍干保護(hù)劑等輔料是在凍干前添加到顆粒懸浮液中的穩(wěn)定劑，常用的是糖類(如海藻糖)或糖醇(如甘露醇)。

關(guān)于使用冷凍保護(hù)劑或凍干保護(hù)劑來(lái)穩(wěn)定納米顆粒的幾個(gè)理論中，非晶玻璃理論最為廣泛接受，具體是指在冷凍過(guò)程中，冷凍保護(hù)劑凝固成顆粒周圍的無(wú)定形玻璃，保護(hù)它們免受融合。2007 年，Jones 等人報(bào)道，在冷凍干燥之前，在自擴(kuò)增 RNA 中加入海藻糖，可以在冷藏條件下保持至少 10 個(gè)月的穩(wěn)定性，并且在轉(zhuǎn)染后，觀察到了高水平表達(dá)[1]。幾年后，mRNA 疫苗對(duì)傳染病(流感)的有效性在動(dòng)物模型中得到證實(shí)。凍干的 mRNA 流感疫苗在小鼠免疫前 37°C 可以穩(wěn)定保存 3 周[2]。該研究小組在后來(lái)的一篇論文中報(bào)道，在 70°C 條件下暴露于抗狂犬病感染的非復(fù)制 mRNA 疫苗并不影響其保護(hù)能力[3]。

CureVac 也報(bào)道，另一種同樣抗狂犬病的 mRNA 疫苗經(jīng)海藻糖凍干，在 5-25°C 下可以穩(wěn)定保存3年，在 40°C 可穩(wěn)定保存 6 個(gè)月[4]。最近，發(fā)表了一項(xiàng)關(guān)于 mRNA 負(fù)載 LNPs 的研究，Zhao 等人比較了兩種不同的長(zhǎng)期儲(chǔ)存mRNA納米顆粒的方法。他們觀察到，盡管使用 20% (w/v)的蔗糖或海藻糖穩(wěn)定了納米顆粒的大小和 mRNA 的體外遞送效率，但相同的顆粒在體內(nèi)遞送效率不高。原因可能是在凍干和重構(gòu)過(guò)程中納米顆粒結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。在添加 5% (w/v)蔗糖或海藻糖的液氮中冷凍裝載 mRNA 的 LNPs 可能是長(zhǎng)期儲(chǔ)存的替代方案[5]。

利用噴霧干燥技術(shù)制備 RNA 疫苗

噴霧干燥提供了一種替代方法來(lái)生產(chǎn)干燥疫苗，這種疫苗能耗更低，操作成本更低，并且避免了細(xì)胞冷凍和高真空。噴霧干燥是一個(gè)連續(xù)的干燥過(guò)程，它包括四個(gè)主要階段：

一個(gè)重要的觀點(diǎn)是，噴霧干燥疫苗可用于非傳統(tǒng)給藥途徑，如口服、肺部或鼻內(nèi)途徑。盡管有這些優(yōu)點(diǎn)，但在噴霧干燥過(guò)程中，由于高溫和剪切力，系統(tǒng)可能不穩(wěn)定。熱應(yīng)力和剪應(yīng)力都增加了動(dòng)能，加劇了顆粒的碰撞。在此過(guò)程中脂質(zhì)部分熔化也會(huì)導(dǎo)致顆粒聚集，因此建議使用熔點(diǎn)高于 70℃ 的脂質(zhì)。粒徑分布、聚合物分散性指數(shù)(Pdi)接近1和高變異系數(shù)的差異是顆粒聚集的信號(hào)?？梢酝ㄟ^(guò)添加合適的穩(wěn)定劑或使用酒精來(lái)代替水溶液分散介質(zhì)可以降低熱應(yīng)力。另一方面，可以通過(guò)使用低脂質(zhì)含量或添加穩(wěn)定劑來(lái)最小化剪切應(yīng)力。糖類是常用的穩(wěn)定劑，但也常添加其他輔料，如二價(jià)離子、蛋白質(zhì)、表面活性劑和聚合物。

1998 年，醫(yī)藥領(lǐng)域?qū)χ|(zhì)納米顆粒進(jìn)行噴霧干燥研究，其作者展示了將固體 LNP 懸浮液成功轉(zhuǎn)化為粉末形式，使用非常低的脂質(zhì)濃度(1%)和高海藻糖濃度(25%)作為噴霧干燥基質(zhì)[6]。在噴霧干燥之前，在脂質(zhì)納米顆粒上添加生物聚合物，如酪蛋白、果膠或木瓜蛋白酶，可以有效防止 LNP 聚集。Gaspar 等人用木瓜蛋白酶層覆蓋固體 LNP，然后用海藻糖或甘露醇噴霧干燥[7]。也有報(bào)道將裝載姜黃素的固體 LNP 用一層果膠進(jìn)行噴霧干燥，然后進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)。交聯(lián)確實(shí)可以改善固體 LNP 的物理化學(xué)性質(zhì)[8]。作者也使用了不同的天然多糖，如果膠、卡拉膠、羧甲基纖維素、阿拉伯膠和海藻酸鹽作為壁材，但都發(fā)生了顆粒聚集。而用果膠或卡拉膠噴霧干燥含有 20-30% 油酸的 LNP 可獲得穩(wěn)定的粉末顆粒[9]。文獻(xiàn)中報(bào)道了聚合物雜交 LNP，例如用透明質(zhì)酸與聚丙烯酸交聯(lián)制備了阿昔洛韋載藥聚合物混合脂質(zhì)納米顆粒。與常規(guī)制劑相比，阿昔洛韋的溶解度可提高 30%，提高了其作為口服給藥系統(tǒng)的生物利用度[10]。最近，Dormenval 等人用甘露醇作為穩(wěn)定賦形劑制備了噴霧干燥負(fù)載 siRNA 的聚合物雜化 LNP。該小組還打算使用微流體技術(shù)進(jìn)一步擴(kuò)大工藝規(guī)模[11]。

目前為止，還沒(méi)有商業(yè)化的噴霧干燥疫苗。然而，已有藥企開(kāi)展了一些研究，特別是以流感和結(jié)核病為重點(diǎn)的研究。關(guān)于噴霧干燥的 mRNA 治療目前報(bào)道研究較少，與噴霧干燥的 mRNA 載藥 LNPs 也較少。Patel等人報(bào)道可吸入的 mRNA 遞送，在他們的研究中， mRNA 通過(guò)霧化方式由超支化聚氨基酯(hPBAEs)傳遞給小鼠，在小鼠肺上皮中觀察到高水平的基因表達(dá)[12]。最近香港大學(xué)的研究人員表明，可以使用噴霧干燥和噴霧冷凍干燥制備可吸入的 mRNA 干粉。這種聚乙二醇化的 KL4/mRNA 復(fù)合物在健康小鼠的肺中產(chǎn)生了良好的基因表達(dá)，并且沒(méi)有引起明顯的毒性和炎癥反應(yīng)[13]。

結(jié)論

基于臨床前和臨床研究，使用 LNPs 作為納米載體的 mRNA 疫苗已顯示出治療多種化學(xué)疾病包括傳染病和癌癥的巨大潛力。LNPs 與其他載體相比具有多種優(yōu)勢(shì)： mRNA 保護(hù)、更高載荷的遞送、靶配體的結(jié)合以及與佐劑的共傳遞。通常情況下，mRNA 疫苗制劑以液態(tài)開(kāi)發(fā)并冷凍儲(chǔ)存。為了優(yōu)化其分布和儲(chǔ)存能力，人們對(duì)開(kāi)發(fā)耐熱的 mRNA 配方產(chǎn)生了興趣。噴霧干燥是傳統(tǒng)凍干技術(shù)的一個(gè)不錯(cuò)替代選擇，因?yàn)閲婌F干燥在顆粒工程和非傳統(tǒng)疫苗給藥途徑有天然優(yōu)勢(shì)。

關(guān)注瑞士步琦，無(wú)論是凍干技術(shù)還是噴霧干燥，都能為您的 RNA 干粉制備提供解決方案。